Western一抗二抗去除液（中性，劇烈型）
|
貨號(hào)
|
名稱
|
規(guī)格
|
|
WS1080-100ml
|
Western一抗二抗去除液（弱堿性，劇烈型）
|
100 ml
|
● 產(chǎn)品組成：
|
貨號(hào)
|
名稱
|
規(guī)格
|
貯存
|
|
WS1080-01
|
Western一抗二抗去除液（中性，劇烈型）
|
100 ml
|
RT
|
|
WS1080-02
|
增強(qiáng)劑
|
1 ml
|
4℃（配成溶液后-20℃貯存）
|
|
|
說(shuō)明書(shū)
|
一份
|
|
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
Western抗體去除液（中性，劇烈型）(Western Antibody Stripping Buffer，neutral，harsh type)可以高效去除印跡膜上的一抗和二抗，而吸附在膜上的抗原基本不受影響，用于Western中轉(zhuǎn)移了蛋白的膜的重復(fù)利用，可以轉(zhuǎn)一次膜，做多次Western印跡實(shí)驗(yàn)，通常可以重復(fù)利用膜2-3次。使用本試劑只需大約20-30分鐘即可實(shí)現(xiàn)蛋白膜的重復(fù)使用，然后可以進(jìn)行Western的后續(xù)操作。以每次使用5 ml Western抗體清除液計(jì)算，本產(chǎn)品可以使用20次。
該產(chǎn)品具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：
1.可用于昂貴或珍稀樣本的多次雜交；
2.有利于用不同抗體分析單次印跡上的不同蛋白，比如不同亞型的抗體；
3.有利于對(duì)異常結(jié)果進(jìn)行重新分析或確認(rèn)；
4.有利于糾正孵錯(cuò)的抗體；
5.節(jié)約試劑成本，并節(jié)約時(shí)間。
各種去除液的選擇請(qǐng)點(diǎn)擊Western一抗二抗去除液選擇指南。
● 貯存：
按照標(biāo)簽溫度貯存，有效期一年；常溫運(yùn)輸。
● 用前必讀：
1. 理想的抗體去除液應(yīng)該是洗脫抗體的同時(shí)，不洗脫膜上結(jié)合的蛋白或者不改變抗原的結(jié)合性質(zhì)，但是目前沒(méi)有一種去除液可以做到只洗脫抗體，而完全不洗脫膜上結(jié)合的抗原；也沒(méi)有一種去除液可以適用于所有不同親和度的抗原抗體復(fù)合物。去除液洗脫能力太強(qiáng)，抗原也容易被洗脫；太弱，則抗體殘留太高。因此，從免疫印跡膜上去除抗體的方案僅能用于定性用途，因?yàn)樵诿總€(gè)抗體清除循環(huán)中，或多或少都將洗去少量膜上的蛋白。
2. PVDF膜比硝酸纖維素膜（NC膜）更堅(jiān)韌，因此優(yōu)先推薦使用PVDF膜用于涉及抗體剝離的實(shí)驗(yàn)。
3. 從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)印完成后立即干燥PVDF膜或NC膜，可改善蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合，特別推薦用于涉及多次抗體剝離的實(shí)驗(yàn)。在第一輪抗體檢測(cè)之前，必須使用甲醇將干燥的PVDF膜潤(rùn)濕或用1×TBST將干燥的NC膜潤(rùn)濕。已經(jīng)結(jié)合有抗體的膜，決不能使得膜干燥，否則抗體分子將與膜結(jié)合緊密，很難剝離。因此，在做完一輪ECL發(fā)光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)后，需要用清除液清除掉膜上的抗體，推薦將膜浸泡于1×TBS（非1×TBST）中4度保存。
4. 檢測(cè)時(shí)，優(yōu)先檢測(cè)低豐度抗原：先孵育條帶較弱（表達(dá)較低）的蛋白，再孵育條帶明顯（表達(dá)較高）的蛋白，最后再孵育內(nèi)參。
5. 如條件允許，下一輪的抗體雜交實(shí)驗(yàn)選擇種屬來(lái)源不同的一抗（對(duì)應(yīng)不同種屬的二抗），減少檢測(cè)的交叉反應(yīng)。
6. 該清除液適用于ECL發(fā)光檢測(cè)的膜上抗體清除，不適合于膜上直接顯色（DAB，BCIP/NBT等），不適合熒光檢測(cè)。
● 使用說(shuō)明：
1. 在完成Western化學(xué)發(fā)光檢測(cè)后，NC膜或PVDF膜用適量蒸餾水中震蕩漂洗5分鐘；重復(fù)漂洗2次；1×TBST漂洗一次。
2. 棄1×TBST，加入適量的Western一抗二抗去除液和1/100體積的增強(qiáng)劑（例如使用5 ml去除液，加50 μl 增強(qiáng)劑）；在搖床上震蕩漂洗20-30分鐘（轉(zhuǎn)速70 -80
rpm）。
|
操作溫度
|
震蕩清除時(shí)間
|
備注
|
|
18℃
|
40-60分鐘
|
冬天實(shí)驗(yàn)室氣溫低時(shí)
|
|
25℃
|
約30分鐘
|
常規(guī)樣品操作
|
|
50℃
|
15-20分鐘
|
膜上蛋白含量高的樣品或清除與膜親和力高的抗體
|
3. 棄去除液，加入足量蒸餾水，在搖床上漂洗2次，每次5分鐘，把去除液徹底漂洗干凈。
注：殘余的去除液會(huì)影響后續(xù)抗原抗體的的結(jié)合。
4. 可選步驟：漂洗后的轉(zhuǎn)印膜孵育ECL發(fā)光液，檢測(cè)二抗的清除效率。曝光5分鐘，膜上看不到發(fā)光條帶表明二抗清除得比較干凈。如果膜上能看到條帶，重復(fù)步驟2-3。
5．繼續(xù)進(jìn)行Western的后續(xù)操作（封閉-抗體孵育-發(fā)光檢測(cè)）。
注：建議每次膜剝離后都要進(jìn)行重新封閉，以降低背景。
● 實(shí)驗(yàn)示例：
Western一抗二抗去除液檢測(cè)效果圖
樣品：293細(xì)胞，Ball-1細(xì)胞總蛋白(TP)，胞漿蛋白(C-Pr)，核蛋白(N-Pr)
電泳條件：12% SDS-PAGE（貨號(hào):RTD6132） 200
V 1×TGS 53 min
轉(zhuǎn)膜條件：NC膜，1×RealBlot
恒流400 mA 35 min
封閉：無(wú)蛋白快速封閉液
RT 60 min
一抗：TBP鼠單抗
1:5000 RT 60min孵育(圖一)
GAPDH兔多抗
1:2000 RT 60 min孵育(圖三)
二抗：羊抗鼠IgG-HRP 1:5000 RT 60min(圖一)
羊抗兔IgG-HRP
1:5000 RT 60 min (圖三)
抗體去除：NC膜蒸餾水漂洗3次，加入5 ml抗體去除液和50 μl
增強(qiáng)劑，常溫，搖床 30 min
ECL曝光5分鐘（圖二），ECL曝光2秒（圖一，圖三）