RealPure Bacterial RNA Extraction Kit
RealPure細(xì)菌RNA提取試劑盒
● 試劑盒內(nèi)容及保存：
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試劑盒組成
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RTR2307
（50次）
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貯存方式
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TE
pH8.0
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10
ml
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常溫
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溶菌酶
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50
mg
首次使用按照標(biāo)簽加入TE
pH8.0
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4℃
加入TE后-20℃貯存
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裂解液RL
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30
ml
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常溫
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去蛋白液RD
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30
ml
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常溫
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漂洗液RW（濃縮液）
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25
ml
首次使用按照標(biāo)簽加入無水乙醇
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常溫
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RNase-free水
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5
ml
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4℃
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DNA清除柱CS（RNase-free）
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50個
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常溫
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RNA吸附柱CR（RNase-free）
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50個
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常溫
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收集管
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100個
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常溫
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2
ml離心管（RNase-free）
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50個
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常溫
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1.5
ml離心管（RNase-free）
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150個
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常溫
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說明書
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1份
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● 儲存條件和效期：
RNase-free水和溶菌酶4℃保存；其他試劑在常溫（25℃左右）干燥條件下，可保存1年。試劑盒常溫運(yùn)輸。
● 產(chǎn)品簡介：
本試劑盒適用于快速提取細(xì)菌總RNA，使用DNA清除柱CS確保有效濾除gDNA殘留，不需要使用DNase消化，得到的RNA可直接用于反轉(zhuǎn)錄PCR，熒光定量PCR.。
● 準(zhǔn)備工作：
1操作前在裂解液RL中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如500
μl RSL中加入5 μl β-巰基乙醇。此裂解液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的
RSL4 ℃可放置3天。
2
按照標(biāo)簽所示在漂洗液RW中加入無水乙醇（自備），混勻后蓋緊瓶蓋后常溫貯存?zhèn)溆谩?
3
按照標(biāo)簽所示在溶菌酶中加入TE溶液，混勻溶解后-20℃貯存。
4
所有離心步驟均在常溫下進(jìn)行。
● 操作步驟：
1. 樣品處理和裂解:
1.1 1-2 ml菌液(約108-109細(xì)胞)加入到1.5
ml離心管中，13000 rpm 離心2
分鐘，棄上清，離心快甩，用移液器吸頭盡可能吸盡上清（如果培養(yǎng)基上清去除不完全，將對細(xì)胞壁的酶解消化過程產(chǎn)生抑制）。
注：E.coli菌株OD600 =0.5 相當(dāng)于1×109個細(xì)菌。
1.2
菌體中加入100 μl酶溶液，渦旋震蕩20秒，
按照下表處理。
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細(xì)菌種類
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酶溶液
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處理
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革蘭氏陰性菌
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大腸桿菌
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1 mg/ml 溶菌酶TE溶液
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常溫5 min
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10mg/ml 溶菌酶用TE稀釋10倍
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革蘭氏陽性菌
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枯草桿菌
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10 mg/ml 溶菌酶TE溶液
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常溫15 min
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試劑盒配套
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金黃色葡萄球菌
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1mg/ml 溶葡球菌酶（lysostaphin）
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37℃ 15 min
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自備
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注：不同細(xì)菌破壁難易程度不同，客戶根據(jù)細(xì)菌種類選擇合適的酶種類和破壁程序。
1.3 酶解后的菌體中加入500 μl裂解液RL（使用前請先檢查是否已加入β-巰基乙醇），混勻。
2. 離心得到上清（可選步驟）：
若沒有不溶性沉淀，直接進(jìn)行步驟3。如有不能裂解的碎片或者不溶物，13,000
rpm離心5 min, 取裂解物上清進(jìn)行下一步。
3. 去除基因組污染和洗脫RNA：
將DNA清除柱CS放入一干凈的2 ml離心管內(nèi)，用移液器小心將步驟2離心管內(nèi)的溶液或離心后的上清全部轉(zhuǎn)移到DNA清除柱CS中，13,000
rpm離心2分鐘（RNA在離心管濾液中，不要丟棄）。
注：確保全部溶液都收集到2 ml離心管中，如果膜上有殘留液體，延長離心時間至5分鐘，保證膜上無殘留液體。
4. RNA掛柱：
向2 ml離心管濾液中加入0.5倍體積的無水乙醇（如濾液體積為500 μl，加入250
μl無水乙醇），此時可能會出現(xiàn)沉淀，立即混勻，不要離心。將全部溶液加入到RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中），13,000 rpm離心1分鐘。
注：確保溶液全部過濾到收集管中，膜上無殘留，如有必要，可以延長離心時間至5分鐘。
5. 去除RNA中的蛋白污染：
向RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl 去蛋白液RD，13,000
rpm離心1分鐘，棄廢液。
6. 去除RNA中的其他雜質(zhì)：
向RNA吸附柱CR中加入700
μl漂洗液RW（使用前請先檢查是否已加入乙醇）， 13,000 rpm離心1分鐘，棄廢液。
7. 進(jìn)一步去除RNA中的其他雜質(zhì)：
向吸附柱CR中加入500
μl漂洗液RW （使用前請先檢查是否已加入乙醇），13,000 rpm離心1
分鐘，棄廢液。
8. 關(guān)鍵步驟：徹底去除吸附柱上的殘余乙醇：
將吸附柱CR放回收集管中，確保蓋好吸附柱管蓋，13,000 rpm將吸附柱CR空甩離心2 分鐘，去除吸附柱上的殘余液體。
注：此步驟目的是將吸附柱中殘余漂洗液去除，如果有漂洗液殘留，可能會影響后續(xù)的RT等實(shí)驗(yàn)操作。
9. 洗脫得到RNA：
將RNA吸附柱CR轉(zhuǎn)入一個新的1.5 ml RNase-free離心管中，向吸附柱O型墊圈中央懸空加入50-100 μl RNase-free水（事先65℃預(yù)熱可提高洗脫效率），蓋好吸附柱管蓋，常溫放置2分鐘，13,000
rpm離心2 分鐘。
注：確保水要加到膜的中央，不要貼壁加入；洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50 μl，體積過小影響回收效率。
10. RNA貯存：
RNA樣品-80℃中保存。
● RNA產(chǎn)量和質(zhì)量的評估：
1. RNA產(chǎn)量：
用分光光度計(jì)測定OD260的吸光值來計(jì)算RNA產(chǎn)量。將RNA按照一定的比例稀釋于TE溶液（10mMTris pH8.0，1mMEDTA）中，根據(jù)以下公式計(jì)算：
A260×稀釋倍數(shù)×40=μg
RNA/ml
注：測定OD值時，盡量不要用RNase-free水稀釋RNA，因?yàn)镽Nase-free水pH較低，測定的OD值偏低。
大腸桿菌DH5α RNA得率為20-30μg/ml 菌液OD600=0.5
2. RNA質(zhì)量：
凝膠電泳檢測：凝膠電泳中，細(xì)菌的完整RNA應(yīng)該有兩條主帶：26S和13S，并且26S亮度應(yīng)該與13S相當(dāng)或是其亮度的2倍。可以使用普通的1×TAE瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度1-1.5
%，可以使用高電壓，短時間電泳，如7V/cm電泳，20分鐘。建議使用D2000
DNA ladder（Cat：RTM415）作為Marker。細(xì)菌26S
rRNA遷移率與800bp類似，13S
rRNA遷移率與700bp類似。
吸光值檢測：可以用A230，A260和A280的數(shù)值表示RNA的純度。純凈的RNA的
A260/A280比值應(yīng)該為2，我們得到的RNA樣品比值應(yīng)在1.8-2.2之間，如果比值低于1.8，表明RNA樣品中蛋白污染比較嚴(yán)重。A260/A230比值應(yīng)該在2-2.2之間。如果此比值低于2，表明RNA樣品中有胍鹽的污染。
● 實(shí)驗(yàn)示例:
細(xì)菌DH5α RNA
1，3 使用DNA清除柱后得到的RNA
1g，2g
DNA清除柱洗脫后殘余的RNA和DNA
1% 瓊脂糖凝膠 1×TAE 150V 20min
M D2000 DNA ladder
2
ml 過夜菌，50 μl洗脫，上樣5 μl
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● 問題指南:
1. 離心柱發(fā)生堵塞
離心柱發(fā)生堵塞之后會造成 RNA 得率降低甚至不能純化得到 RNA。
常見原因分析如下：
1.1細(xì)菌破碎不徹底。
細(xì)菌破碎不徹底會使吸附柱發(fā)生堵塞，同時會影響 RNA 得率及質(zhì)量。我們建議在進(jìn)行細(xì)菌破壁時，盡量破碎細(xì)菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等組織。
1.2 樣本初始量過多。
樣本使用量過多會導(dǎo)致裂解液RL plus裂解細(xì)胞時不完全，導(dǎo)致離心柱堵塞。該試劑盒處理樣本的初始最大量108-109細(xì)菌細(xì)胞。
1.3 離心機(jī)的溫度過低。
整個 RNA 分離純化所有的步驟均在常溫（20-25℃）進(jìn)行。有些低溫離心機(jī)的溫度低于 20℃，可能會造成離心柱的堵塞。如果發(fā)生這種現(xiàn)象，請將離心機(jī)溫度設(shè)置到
20-25℃。
2. 提取不到RNA或者RNA產(chǎn)量低
通常會有多種因素影響回收效率，比如：樣本 RNA 含量、操作方法、洗脫體積等。
常見原因分析：
2.1 樣本保存不當(dāng)或樣本保存時間過久導(dǎo)致RNA 已經(jīng)降解。
建議：新采集的樣本應(yīng)立即放入液氮中速凍，長期保存于-70℃并避免樣本的反復(fù)凍融；或者將樣本立即浸泡在 RNA 穩(wěn)定劑RNAwait溶液中。
2.2 樣本破碎裂解不充分導(dǎo)致純化柱堵塞。
建議：溶菌酶破壁時，確保破壁完全。革蘭氏陽性菌注意破壁溫度和時間。
2.3 洗脫液添加不正確。
建議：確認(rèn) RNase-Free 水滴加到了純化柱膜O型墊圈中央位置。
2.4 漂洗液RW中沒有添加正確體積的無水乙醇。
建議：請按照說明書，在試劑盒使用前，漂洗液RW中添加正確體積的無水乙醇并混勻。
2.5 組織樣本用量不合適。
建議：每 500 μl 裂解液RL使用最大細(xì)菌量109，使用過多會導(dǎo)致
RNA 提取量降低并且得到的
RNA 純度也會降低。我們強(qiáng)烈建議每單次
RNA提取操作，樣本初始用量一定不要超過最大建議量。
2.6 洗脫體積不合適或洗脫不徹底。
建議：純化柱的洗脫液體積為 50-100 μl；若洗脫效果并不理想，建議在加入65℃預(yù)熱的RNase-Free 水后，延長常溫放置的時間，例如放置
5-10 min。
2.7 純化柱在第二次RW洗滌之后有乙醇?xì)埩簟?
建議：漂洗液RW洗滌后，吸附柱空甩離心2 min是關(guān)鍵步驟，以充分除去吸附柱上殘留的乙醇。
3. 純化獲得的RNA有降解
純化得到的 RNA 的質(zhì)量和樣本的保存、RNase 污染、操作等因素有關(guān)。
常見原因分析：
3.1 組織樣本采集后沒有及時保存。
建議：組織樣本在收集后若不及時使用，請立即低溫保存于液氮中或經(jīng)液氮速凍后立即轉(zhuǎn)移至-70℃
長期保存，或者將樣本立即浸泡在 RNA 穩(wěn)定劑 RNAwait溶液中。提取 RNA 請盡量使用新近采取的組織樣本。
3.2 組織樣本反復(fù)凍融。
建議：組織樣本保存時，最好分裝成小份，使用時取出其中一份即可，避免樣本的反復(fù)凍融導(dǎo)致 RNA 的降解。
3.3 操作間有 RNase 引入或沒有佩戴一次性手套、口罩等。
建議：RNA 提取實(shí)驗(yàn)最好在單獨(dú)的 RNA 操作間進(jìn)行，并在實(shí)驗(yàn)前清理好實(shí)驗(yàn)桌，實(shí)驗(yàn)時佩戴一次性手套、口罩，最大程度上避免
RNase 引入導(dǎo)致的RNA
降解。
3.4 試劑在使用過程中被 RNase 污染。
建議：更換新的植物總RNA 提取系列試劑盒進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
3.5 RNA 操作時所用的離心管、槍頭等有 RNase 污染。
建議：確認(rèn) RNA 提取時所用到的離心管、槍頭、移液器等都是 RNase-Free。
4. RNA中含有DNA污染
4.1 提取的起始菌體量超過最大建議量
建議：步驟1-樣品處理時使用108-109細(xì)菌，不要超過最大處理量，否則樣品的核酸量會超過DNA清除柱CS的處理極限，導(dǎo)致洗脫下的RNA有基因組DNA的污染。
4.2 省略了步驟3-去除基因組污染步驟。
建議：步驟3-去除基因組污染步驟必不可少，不能省略。DNA清除柱CS能極大限度的去除上清液中的基因組
DNA，使用裂解液RL
plus洗脫下的RNA基本無基因組DNA的污染。
4.3 跳過了使用去蛋白液RD的漂洗步驟（見操作步驟第5步）。
建議：這一步驟對于除去殘留的 DNA 以及雜質(zhì)蛋白十分重要，一定不能省略，否則將會導(dǎo)致純化得到的
RNA 中含有DNA
污染和蛋白污染。
5. 純化獲得的RNA影響下游實(shí)驗(yàn)
經(jīng)吸附柱純化的 RNA，如果鹽離子、蛋白質(zhì)含量過多會影響下游實(shí)驗(yàn)，比如：逆轉(zhuǎn)錄、Northern
Blot 等。
1. 洗脫后的 RNA 有鹽離子殘留。
建議：確認(rèn)漂洗液RW中添加了正確體積的乙醇，并按操作說明的離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行2次RW洗滌吸附柱 （見操作步驟第6，7步）。
2. 洗脫后的 RNA 有乙醇?xì)埩簟?
建議：確認(rèn) RW第二次洗滌后，按操作說明的對吸附柱進(jìn)行空管離心操作（見操作步驟第8
步），如果還有乙醇?xì)埩?，可以將空管離心后吸附柱開蓋常溫放置
5 min，以最大程度上去除乙醇?xì)埩簟?