動物核蛋白與胞漿蛋白提取試劑盒
Animal Nuclear and Cytoplasmic Protein
Extraction Kit Ver 20260127-2.0
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產(chǎn)品貨號
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名稱
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規(guī)格
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RTD8303
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動物核蛋白與胞漿蛋白提取試劑盒
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50 次
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● 產(chǎn)品簡介：
在研究細(xì)胞時經(jīng)常要研究細(xì)胞的不同組份，而研究得最多的兩個細(xì)胞組份就是細(xì)胞核和細(xì)胞漿。分離核蛋白和胞漿蛋白，不僅可以用于研究蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，而且可以用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的研究，例如EMSA(也稱gel
shift)，footprinting等。動物核蛋白與胞漿蛋白提取試劑盒提供了一種比較簡單方便地從組織和培養(yǎng)細(xì)胞中抽提細(xì)胞核蛋白與胞漿蛋白的方法。約90分鐘就可以完成細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白的分離。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，報告基因檢測以及酶活力測定等實驗。
本試劑盒是通過抽提試劑A與抽提試劑B協(xié)同作用，破壞細(xì)胞膜，釋放出胞漿蛋白，然后通過離心得到細(xì)胞核；再用高鹽的細(xì)胞核蛋白抽提試劑抽提得到核蛋白。一般情況下，胞漿蛋白與核蛋白之間的交叉污染低于10%。提取得到的胞漿蛋白含有非離子去垢劑，保持了蛋白活性；提取得到的核蛋白為可溶性核蛋白（不包括核膜蛋白和核骨架蛋白），不含去垢劑，由于鹽離子濃度較高，可能需要脫鹽或稀釋后用于相關(guān)實驗。
對于細(xì)胞樣品，如果細(xì)胞數(shù)量在二百萬（2×106），本試劑盒可以抽提50個樣品；對于組織樣品，如果每個樣品重量為20毫克，本試劑盒可以抽提50個樣品。
● 產(chǎn)品組成：
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產(chǎn)品編號
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名稱
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規(guī)格
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貯存
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RTD8303-01
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細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A
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20 ml
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-20℃
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RTD8303-02
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細(xì)胞漿蛋白抽提試劑B
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0.5 ml
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-20℃
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RTD8303-03
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細(xì)胞核蛋白抽提試劑
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5 ml
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-20℃
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● 貯存、效期及運輸：
-20℃貯存；有效期一年；試劑盒濕冰運輸。
● 用前必讀：
1. 離心機(jī)請調(diào)整成RCF/g模式，按照離心力設(shè)置離心機(jī)（不要根據(jù)轉(zhuǎn)速rpm模式設(shè)置），所有離心步驟都需要在4℃低溫離心機(jī)中進(jìn)行。
2. 蛋白提取推薦添加蛋白酶抑制劑如100
mM PMSF（100×）（自備，試劑盒不提供），添加時按照1:100添加。研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制劑（自備，試劑盒不提供）。
3. 蛋白定量推薦使用BCA方法，可以選擇BCA蛋白濃度測定試劑盒。
● 使用方法：
一. 實驗步驟：
1.1準(zhǔn)備溶液：常溫溶解試劑盒中的試劑，溶解后立即放置在冰上，混勻。取適當(dāng)量的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A和細(xì)胞核蛋白抽提試劑，在使用前加入PMSF溶液（使得PMSF終濃度為1
mM）和/或磷酸酶抑制劑（自備，試劑盒不提供），隨后立即放于冰上待用。
1.2
準(zhǔn)備細(xì)胞：
1.2.1
對于貼壁細(xì)胞：用PBS漂洗一遍，棄PBS；再加入適量PBS，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，或用0.02%
EDTA（0.5
mM）溶液處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細(xì)胞。450
g 4℃離心5
min收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細(xì)胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。
1.2.2
對于懸浮細(xì)胞：450
g 4℃離心5
min收集細(xì)胞，用PBS洗一遍，離心收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。
1.3 按照下表大體估算提取溶液使用體積：
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細(xì)胞類型
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培養(yǎng)器皿
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細(xì)胞數(shù)量
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細(xì)胞沉淀體積（PCV）（μl）
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細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A（μl）
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懸浮細(xì)胞
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2×106
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~20
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200
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貼壁細(xì)胞
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96孔板
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~1×105
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調(diào)整細(xì)胞數(shù)目到2×106
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24孔板
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~5×105
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調(diào)整細(xì)胞數(shù)目到2×106
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6孔板
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~2.5×106
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調(diào)整細(xì)胞數(shù)目到2×106
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25cm2培養(yǎng)瓶
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~2×106
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~20
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75cm2培養(yǎng)瓶
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~8×106
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調(diào)整細(xì)胞數(shù)目到2×106
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35 mm培養(yǎng)皿
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~2×106
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~20
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60 mm培養(yǎng)皿
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~5×106
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調(diào)整細(xì)胞數(shù)目到2×106
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100 mm培養(yǎng)皿
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~1.5×107
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調(diào)整細(xì)胞數(shù)目到2×106
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注：(二百萬，2×106)HeLa細(xì)胞，其細(xì)胞沉淀體積（PCV，Packed Cell Volume）大約為20 μl。
1.4 胞漿蛋白提取：
1.4.1細(xì)胞沉淀中加入準(zhǔn)備好的200
μl細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A（確保已添加蛋白酶抑制劑），用1 ml吸頭吹打重懸細(xì)胞沉淀5-10次，把細(xì)胞沉淀完全懸浮并分散開,冰浴5分鐘。
1.4.2
關(guān)鍵步驟：加入10
μl 細(xì)胞漿蛋白抽提試劑B（按照細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A體積的1/20加入），混勻，冰浴10分鐘。
注：此步驟盡量不要漩渦震蕩沉淀，否則得到的細(xì)胞漿蛋白可能會污染核蛋白。
1.4.3
4℃ 16000g 離心5分鐘，取80%上清即為胞漿蛋白，保存?zhèn)溆谩?
注：吸取上清時千萬不要觸及沉淀，可以只取80%體積上清，以免胞漿蛋白中污染細(xì)胞核。每2×106細(xì)胞用200
μl細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A裂解后獲得的上清，其細(xì)胞漿蛋白濃度約為1-2 μg/μl，不同細(xì)胞略有不同。
1.5 細(xì)胞核蛋白提?。?/b>
注：此步驟使用細(xì)胞核蛋白抽提試劑（高鹽緩沖液）使得細(xì)胞核收縮，核酸結(jié)合蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子）與核酸分離，擴(kuò)散到細(xì)胞核外部，離心后上清中為可溶性非變性（活性）核蛋白，適用EMSA，轉(zhuǎn)錄因子活性分析等實驗。
1.5.1徹底去除步驟1.4.3離心管內(nèi)上清，沉淀中再次加入200
μl細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A（含PMSF），用1 ml吸頭吹打重懸沉淀至沉淀完全散開（注：渦旋震蕩不易懸浮沉淀），冰浴5分鐘；4℃
16000 g 離心5分鐘，徹底去除上清，沉淀即為完整的細(xì)胞核。
注：此步驟目的是徹底漂洗沉淀中殘余的未裂解細(xì)胞，可以大大提高細(xì)胞核的純度；上清必須徹底去除干凈，否則會導(dǎo)致細(xì)胞核蛋白中污染胞漿蛋白。
1.5.2
沉淀中加入100
μl細(xì)胞核蛋白抽提試劑（確保已經(jīng)添加PMSF），吸頭重懸沉淀，4℃旋轉(zhuǎn)混勻30
min，至最后得到的溶液無可見懸浮物。
注：如不能旋轉(zhuǎn)混勻，可以冰浴30 min，每隔5分鐘渦旋混勻一次。
1.5.3
4℃16,000 g離心10分鐘，立即吸取上清至一預(yù)冷的離心管中，即為抽提得到的活性核蛋白?？梢粤⒓词褂茫部梢?80℃凍存。每2×106細(xì)胞提取的細(xì)胞核蛋白濃度約為1-3
μg/μl（可以使用BCA蛋白濃度測定試劑盒定量），不同細(xì)胞略有不同。
1.6對于新鮮組織：
1.6.1
組織勻漿（關(guān)鍵步驟）：
把組織盡可能切成非常細(xì)小的碎片。按照
20:1 的比例混合細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A和B(例如 200 微升細(xì)胞漿蛋白抽提試劑 A 中加入 10 微升細(xì)胞漿蛋白抽提試劑 B)，并加入
PMSF 至終濃度為 1 mM
配制成組織勻漿液。按照每 20 mg 組織加入大約200 微升組織勻漿液的比例在1 ml玻璃勻漿器內(nèi)冰浴充分勻漿5-10次。 鑒定方法：取10
μ l勻漿5次后的組織樣品，加入等體積的臺盼藍(lán)染色液，混勻，在顯微鏡下觀察臺盼藍(lán)溶液染色陽性（藍(lán)色）細(xì)胞數(shù)目的比例，當(dāng)陽性（藍(lán)色）細(xì)胞破碎達(dá)到50%即可停止勻漿，請勿過度勻漿。若陽性（藍(lán)色） 細(xì)胞比例未達(dá)到50%，適當(dāng)增加1-2次勻漿，隨后按照同樣的方法使用臺盼藍(lán)溶液進(jìn)行鑒定。
1.6.2
組織裂解：
勻漿后把勻漿液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，冰浴放置15分鐘，間歇混勻或者4℃旋轉(zhuǎn)混勻15 分鐘。
1.6.3提取組織細(xì)胞漿蛋白：
4℃ 16000 g 離心5分鐘，取80%上清即為胞漿蛋白，保存?zhèn)溆谩?
注：吸取上清時千萬不要觸及沉淀，可以只取80%體積上清，以免胞漿蛋白中污染細(xì)胞核。
1.6.4
組織細(xì)胞核蛋白提?。?
徹底去除步驟1.6.3中的上清，得到的沉淀按照步驟1.5進(jìn)行。新鮮的肝臟組織用本產(chǎn)品裂解后獲得的上清，其細(xì)胞漿蛋白濃度約為1-5
μg/μl，細(xì)胞核蛋白濃度約為1-5
μg/μl，不同狀態(tài)的不同組織有所不同。
二 關(guān)于胞漿蛋白和核蛋白產(chǎn)量和質(zhì)量的評價：
2.1蛋白產(chǎn)量：
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組織
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組織重量
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胞漿蛋白
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核蛋白
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腦
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~50 mg
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~1.2 mg
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~70 μg
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肝臟
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~50 mg
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~3.4 mg
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~80 μg
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心臟
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~50 mg
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~1.6 mg
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~140 μg
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肺
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~50 mg
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~1.5 mg
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~70 μg
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2.2 胞漿蛋白和核蛋白質(zhì)量評價：
蛋白分區(qū)提取的質(zhì)量評價首先看提取的蛋白是否是分區(qū)蛋白，其次要看分區(qū)蛋白是否有明顯的富集，其三要看提出的分區(qū)蛋白是否有其他組分交叉污染，最后看提取的分區(qū)蛋白中是否可以檢測出目的蛋白。使用專門的胞漿內(nèi)參和細(xì)胞核內(nèi)參（下表），可以初步確認(rèn)提出的是胞漿蛋白還是核蛋白。蛋白是否有效富集需要用總蛋白作為對照，與總蛋白相比，胞漿蛋白內(nèi)參或核內(nèi)參是否有明顯富集。交叉污染可以用其他組分內(nèi)參檢測蛋白樣品，如關(guān)注胞漿蛋白中是否有細(xì)胞核蛋白污染，可以使用核蛋白內(nèi)參如Lamin
B1檢測胞漿蛋白，檢測無條帶即說明胞漿蛋白與細(xì)胞核組分無交叉污染。用目標(biāo)蛋白抗體檢測分區(qū)蛋白，驗證是否可以檢測到目的蛋白，蛋白大小是否符合預(yù)期。
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位置
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內(nèi)參名稱
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大小 kD
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備注
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胞漿蛋白內(nèi)參
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GAPDH
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37
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β-Actin
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45
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β-Tubulin
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55
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推薦
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核內(nèi)參
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Histone H3
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17
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H3出存在于細(xì)胞核內(nèi)，也存在于線粒體中，胞漿中可以檢測到
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PCNA
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36
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Lamin B1
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68
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推薦
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三. 實驗示例：
3.1
K562細(xì)胞臺盼藍(lán)染色：
3.2
K562細(xì)胞核漿分離WB檢測：
Jurkat總蛋白，細(xì)胞漿蛋白，細(xì)胞核蛋白GAPDH檢測
總蛋白提?。?/b>4×106 K562細(xì)胞，400
g 離心收集，去上清，沉淀中加入200
μl RIPA（加2
μl 100 mM PMSF），冰上裂解5分鐘，4℃ 16000 g 15 分鐘，上清即為總蛋白（TP）。
細(xì)胞漿蛋白：4×106 K562細(xì)胞，400
g 離心收集，加入400
μl細(xì)胞裂解緩沖液A （加4
μl 100mM PMSF，加0.4 μl 1 M DTT），懸浮沉淀，冰浴5分鐘；加入20 μl細(xì)胞裂解緩沖液B，混勻，冰上孵育5分鐘，4℃ 16000g 5分鐘，小心收集上清即為細(xì)胞漿蛋白（CP），不要觸及沉淀。
細(xì)胞核蛋白提?。?/b>沉淀中計入100
μl核蛋白提取試劑I（變性），1
μl Benzonase，37℃ 30
min，4 ℃ 16000 g 10分鐘，上清即為細(xì)胞核蛋白（NP）。
電泳：RTD6117-0420
200V 33-12 mA 55 min
轉(zhuǎn)膜：NC膜，1×RealBlot快速轉(zhuǎn)膜液濕轉(zhuǎn)，穩(wěn)流400
mA，電壓變化64-57
V，轉(zhuǎn)膜時間35
min
封閉：無蛋白快速封閉液RT
10 min
一抗孵育；二抗孵育；檢測：ECL發(fā)光檢測