細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒
Ver 20260118-3.0
|
貨號(hào)
|
名稱
|
規(guī)格
|
|
RTD8112
|
細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒
|
50次
|
● 產(chǎn)品簡介
細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒提供了一種比較簡單、方便地從培養(yǎng)細(xì)胞或組織中抽提細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞漿蛋白的方法。抽提的膜蛋白不僅包括質(zhì)膜上的膜蛋白，也包括線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和高爾基體膜（不包含核膜）等上的膜蛋白。
本試劑盒通過膜蛋白抽提試劑A通透細(xì)胞，經(jīng)低速離心沉淀去除細(xì)胞核和少數(shù)未破碎的細(xì)胞，隨后取上清高速離心獲得細(xì)胞膜沉淀和含有細(xì)胞漿蛋白的上清，然后通過優(yōu)化的膜蛋白抽提試劑B（含去垢劑）從沉淀中抽提獲取膜蛋白。
約90分鐘即可完成培養(yǎng)細(xì)胞或組織的細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白的分離和抽提。抽提得到的蛋白可以用于SDS-PAGE，Western、酶活性測定等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
由于提取的膜蛋白樣品中含有去垢劑，不建議用于非變性電泳（BN電泳，Tris-甘氨酸非變性電泳，Bis-Tris非變性電泳）。
本試劑盒按照本說明書的操作步驟，如果每次使用細(xì)胞的數(shù)量為2-5×107或組織重量為100
mg，本試劑盒可以提取50個(gè)樣品。
● 產(chǎn)品組成
|
產(chǎn)品編號(hào)
|
名稱
|
規(guī)格
|
|
RTD8112-01
|
膜蛋白抽提試劑A
|
50 ml
|
|
RTD8112-02
|
膜蛋白抽提試劑B
|
10 ml
|
|
YMC07-05
|
塑料研磨杵
|
5根/包
|
|
|
說明書
|
-
|
● 貯存、效期和運(yùn)輸：
-20℃貯存；有效期一年；試劑盒濕冰運(yùn)輸。
● 用前必讀：
1. 離心機(jī)請(qǐng)調(diào)整成RCF/g模式，按照離心力設(shè)置離心機(jī)（不要根據(jù)轉(zhuǎn)速rpm模式設(shè)置），所有離心步驟都需要在4℃低溫離心機(jī)中進(jìn)行。
2. 將膜蛋白抽提試劑A和B溶化混勻后放置于冰上預(yù)冷。
3. 蛋白提取推薦添加蛋白酶抑制劑（自備，試劑盒不提供），根據(jù)蛋白酶抑制劑母液濃度提前添加在膜蛋白抽提試劑中（如抑制劑母液是 100×，添加時(shí)按照1:100添加，即1ml膜蛋白抽提試劑添加10μl抑制劑）。研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制劑（自備，試劑盒不提供）。
● 實(shí)驗(yàn)流程圖：
● 使用方法：
自備材料：
1×PBS；臺(tái)盼藍(lán)染色液；蛋白酶抑制劑或磷酸酶抑制劑；剪刀或刀片；冰；1.5
ml離心管。
1. 準(zhǔn)備溶液：
混勻膜蛋白抽提試劑，立即放置在冰上。取適當(dāng)量的溶液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑（自備，試劑盒不提供），隨后立即放于冰上待用。
2. 準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣品：
2.1細(xì)胞樣品：
2.1.1
對(duì)于貼壁細(xì)胞：
培養(yǎng)約2000-5000萬（2-5×107）細(xì)胞，細(xì)胞用PBS漂洗一遍，棄PBS；再加入適量PBS，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，或用0.02%
EDTA（0.5
mM）溶液處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細(xì)胞。400
g（~2000
rpm） 4℃離心5
min收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細(xì)胞，以免胰酶降解需提取的目的蛋白。
2.1.2
對(duì)于懸浮細(xì)胞：
培養(yǎng)約2000-5000萬（2-5×107）細(xì)胞，400
g（~2000
rpm）4℃離心5
min收集細(xì)胞，用PBS洗一遍，離心收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。
2.1.2 細(xì)胞預(yù)處理（關(guān)鍵步驟）：
把1 ml膜蛋白抽提試劑A加入細(xì)胞沉淀中，輕輕并充分懸浮細(xì)胞，4度旋轉(zhuǎn)混勻10分鐘或冰浴10分鐘（間歇顛倒輕柔混勻3次）；不要?jiǎng)×覝u旋震蕩。
注：此步驟是通透細(xì)胞膜，可以用臺(tái)盼藍(lán)染色快速判斷通透是否合適，取10 μl裂解溶液加等體積臺(tái)盼藍(lán)染色液，染色后大多數(shù)細(xì)胞應(yīng)臺(tái)盼藍(lán)陽性（藍(lán)染主要局限在細(xì)胞輪廓內(nèi)；細(xì)胞輪廓完整，細(xì)胞仍是規(guī)則圓形/橢圓形；看不到大量碎片或彌散染料）；避免通透過度：一旦出現(xiàn)大量細(xì)小顆粒，看不到細(xì)胞輪廓，出現(xiàn)“藍(lán)點(diǎn)霧化/碎片云”就是通透過度，此時(shí)會(huì)導(dǎo)致膜漿交叉污染。
2.2組織樣品：
2.2.1
組織漂洗：取約100
mg新鮮組織，用1×PBS清洗兩次，棄凈清洗液。
2.2.2 組織破碎（關(guān)鍵步驟）：用剪刀或刀片盡量小心剪切成細(xì)小的組織碎片，置于1.5
ml離心管中，先加入0.5
ml膜蛋白抽提試劑A，輕輕懸浮組織碎片；用塑料研磨杵在1.5
ml離心管中旋轉(zhuǎn)研磨組織2-5次，至組織成為勻漿懸浮液，再補(bǔ)加入0.5
ml 膜蛋白抽提試劑A，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)研磨2-3次，每100
mg組織需要使用1
ml抽提試劑A。
注：此勻漿步驟為關(guān)鍵環(huán)節(jié)，質(zhì)地較軟的組織如肺，肝臟，腎臟，腦組織推薦使用配套的塑料研磨杵研磨組織。質(zhì)地硬的組織如肌肉組織可以使用玻璃勻漿器勻漿。如果使用玻璃勻漿器勻漿，要使用松散型間距的玻璃勻漿器，因?yàn)榫o致型間距的玻璃勻漿器極易導(dǎo)致組織勻漿過度。勻漿次數(shù)原則是寧少勿多，建議初始勻漿次數(shù)2-3次，過度勻漿會(huì)導(dǎo)致膜漿交叉污染。破碎效果與組織細(xì)胞類型有關(guān)，不同的樣品所需勻漿次數(shù)不同。鑒定方法：取10
μl勻漿后的樣品，加入等體積的臺(tái)盼藍(lán)溶液，混勻，在顯微鏡下觀察臺(tái)盼藍(lán)溶液染色陽性（藍(lán)色）細(xì)胞數(shù)目的比例，當(dāng)陽性（藍(lán)色）細(xì)胞破碎達(dá)到80%即可停止勻漿，請(qǐng)勿過度勻漿。若陽性（藍(lán)色）細(xì)胞比例未達(dá)到80%，適當(dāng)增加1-2次勻漿，隨后按照同樣的方法使用臺(tái)盼藍(lán)溶液進(jìn)行鑒定。
2.2.3
勻漿后的懸液4度旋轉(zhuǎn)混勻10分鐘或冰浴10分鐘（間歇顛倒輕柔混勻3次）；不要?jiǎng)×覝u旋震蕩。
3. 去除細(xì)胞核：
將細(xì)胞處理液或組織勻漿液700 g（~2700
rpm） 4℃離心10分鐘，小心將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5
ml離心管中。注：轉(zhuǎn)速不要超過700
g，否則會(huì)降低膜蛋白的得率。
關(guān)鍵步驟：吸取上清時(shí)不要觸及沉淀，可以只吸取80%體積上清，以免上清中污染核蛋白。此步驟得到的細(xì)胞核純度不高，混雜有沒有完全破碎的完整細(xì)胞，不建議用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
4. 沉淀膜蛋白：
上清溶液16000
g（~13000
rpm） 4℃離心15分鐘，沉淀即為提取的膜蛋白。
5. 收集胞漿蛋白：
5.1小心吸取上清置于1.5
ml離心管中，吸取上清時(shí)可以有30-50微升上清殘留，以避免接觸沉淀導(dǎo)致胞漿蛋白中污染膜蛋白。
5.2
為提高胞漿蛋白純度，上清溶液16000
g（~13000
rpm） 4℃再次離心15分鐘，收集上清即為最終的胞漿蛋白，可-70℃保存?zhèn)溆谩?
注：每5000萬細(xì)胞使用本產(chǎn)品裂解可獲得5-30
mg細(xì)胞漿蛋白, 不同細(xì)胞有所不同。
6. 抽提膜蛋白：
6.1
膜蛋白漂洗：
去除步驟4膜蛋白沉淀中殘余的上清，加入預(yù)冷的1 ml 1×PBS懸浮沉淀，4℃，16000
g（~13000
rpm）離心5
min，去除上清；重復(fù)漂洗一次。
注：此步驟能去除粘連在膜蛋白表面的胞漿蛋白，提高膜蛋白的純度。
6.2
膜蛋白溶解：
盡最大努力吸盡上清（可以輕輕觸碰到沉淀，甚至吸走很少量的沉淀）。加入100微升膜蛋白抽提試劑B，移液器輕輕吹打多次以獲得均質(zhì)的懸液，置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上，4°C孵育30
min或者渦旋劇烈震蕩，冰浴處理30
min，間歇?jiǎng)×艺鹗?-5次。
6.3
膜蛋白收集：
4℃，16000
g（~13000
rpm）離心15分鐘，收集上清即為細(xì)胞膜蛋白溶液。可-70℃保存?zhèn)溆谩?
注：每5000萬細(xì)胞使用本產(chǎn)品裂解可獲得0.3-3 mg細(xì)胞膜蛋白, 不同細(xì)胞有所不同。
7. 膜蛋白樣品處理（變性）：
測定提取膜蛋白濃度，根據(jù)濃度混合細(xì)胞膜蛋白樣品和SDS-PAGE上樣緩沖液，根據(jù)膜蛋白性質(zhì)進(jìn)行變性處理，直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。
注：對(duì)于多次跨膜蛋白（Multi-pass
membrane protein）的變性電泳檢測，樣品建議使用37℃處理30分鐘或者50度處理10分鐘，不要95℃或煮沸加熱處理，因?yàn)樵诟邷厍闆r下，多次跨膜蛋白極易聚集形成多聚體，樣品會(huì)聚集，WB檢測會(huì)表現(xiàn)為比實(shí)際蛋白大小更大的分子量，如一些ATPase、ABC、SLC、GLUT家族蛋白。
8. 實(shí)驗(yàn)示例：
小鼠肺組織，Jurkat
膜漿分離
提取過程簡述：100
mg冷凍肺組織，PBS漂洗兩次，1 ml
抽提試劑A，玻璃勻漿器勻漿10次（過度勻漿）；1×107 Jurkat 細(xì)胞，PBS漂洗一次，1 ml
抽提試劑A，不勻漿； 4度旋轉(zhuǎn)混勻10 min；700
g去核；上清16000
g 30min，上清為CY，各約0.8
ml，肺組織CY濃度6
μg/μl，Jurkat
CY濃度0.7
μg/μl；沉淀PBS漂洗一次，肺組織沉淀中加200
μl 抽提試劑B，Jurkat沉淀加100
μl 抽提試劑B；4度旋轉(zhuǎn)混勻45min，16000
g 15min取上清為膜蛋白M，肺組織膜蛋白濃度3.7
μg/μl，Jurkat
膜蛋白濃度0.3
μg/μl。
電泳：RTD6119-0420
11孔預(yù)制膠Lot#85129006；蛋白上樣20 μl/4
μg
轉(zhuǎn)膜：1×快速轉(zhuǎn)膜液加10%乙醇，恒流400
mA，電壓變化72-60
V 40min
Na-K
ATPase抗體：康何欣CMA5242重組兔單抗 1：2000
Calnexin抗體：華安ET1611-86 兔單抗 1：500（煮沸剝離后孵育）
LB1：華安ET1606-27
兔單抗 1：3000
β-Tubulin
Abmart M20005S 鼠單抗 1：2500（煮沸剝離后孵育）
GAPDH
華安ET1601-4
兔單抗 1：10000（煮沸剝離后孵育）
COXIV
華安ET1701-63
兔單抗1：3000
1.在組織樣本中過度勻漿會(huì)導(dǎo)致線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器與膜碎片和細(xì)胞骨架形成大分子復(fù)合體，從而在低速（700
g）離心條件下與細(xì)胞核共同沉淀。解釋了在肺組織膜蛋白中看不到Calnexin和COXIV；
2.Jurkat
抽提試劑A中可以實(shí)現(xiàn)高度選擇性的質(zhì)膜破裂，使胞漿蛋白主要分布于胞漿組份而膜蛋白富集于膜組份。